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隨著微生物快檢技術日漸頻繁地應用于制藥、干細胞和細胞治療行業，替代方法驗證成為了大部分質量管理和檢驗人員難以跨越的一個難題。

今天本文將通過Q&A的形式就相關法規和方案實踐進行簡單分享，Let's go！         

01

Q：關于快速無菌檢查方法，中國藥典有沒有描述推薦的產品？

A：沒有，根據ChP《9201藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則》，有推薦的檢測技術。

9201 藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則

本指導原則是為所采用的的試驗方法能否替代藥典規定的方法用于藥品微生物的檢驗提供指導。

隨著微生物學的迅速發展，制藥領域不斷引入了一些新的微生物檢驗技術，大體可分為三類：

? 基于微生物生長信息的檢驗技術，如生物發光技術、電化學技術、比濁法等；

? 直接測定被測介質中活微生物的檢驗技術，如固相細胞計數法、流式細胞計數法等；

? 基于微生物細胞所含有特定組成成分的分析技術，如脂肪酸測定技術、核酸擴增技術、基因指紋分析技術等。

這些方法與傳統檢查方法比較，或簡便快速，或具有實時或近實時監控的潛力，使生產早期采取糾正措施及監控和指導優良生產成為可能，同時新技術的使用也促進了生產成本的降低及檢驗水平的提高。

02

Q：關于快速微生物培養方法，其它技術指南有推薦嗎？

A：有，PDA《TR33 可選擇的和快速的微生物檢測方法的評價驗證與執行》推薦了熒光染色發光技術，商品化產品為默克Milliflex Quantum快速微生物培養系統。

03

Q：關于快速無菌檢查替代方法的驗證，需要驗證什么項目，怎樣做？

A：無菌檢查方法屬于定性檢驗，需要驗證專屬性、檢測限、耐用性、重現性；

? 專屬性

目的：評估不同種類的微生物能否在規定的時間內生長；

方法：分別接種不大于100cfu的六種標準菌株(如有環境污染菌更佳)至特定培養基中，按特定的溫度要求培養，接種緩沖液至陰性對照中；環境污染菌目前的應用有三種程度，1是不用，2是選用，3是分析用；

接受標準：5天內陽性對照的微生物生長良好，陰性對照無微生物生長，則設定5天為報陰時間；否則以微生物檢出時間下限為報陰時間。

? 檢測限

目的：評估樣品中能被檢出微生物的數量下限；

方法：方法同專屬性，接種不大于10cfu的標準菌株；指導原則雖然推薦不大于5cfu的菌，但通過反復的實驗證明，其較大可能會獲得假陰性結果，參考指導原則中“確認其應用效果優于或等同于藥典的方法”，其檢測限不大于100cfu即可；

接受標準：5天內陽性對照的微生物生長良好，陰性對照無微生物生長，以菌落數目上限作為檢測限。

? 重現性

目的：評估檢驗方法在檢驗結果上抵抗操作和環境變化的能力；

方法：方法同專屬性，兩個人員，不同時間，各重復三次；

接受標準：5天內陽性對照的微生物生長良好，陰性對照無微生物生長，該接受標準高于卡方檢驗。

卡方檢驗：P值大于0.05則兩種方法之間不存在顯著性差異。

下圖為例：

? 耐用性

目的：評估檢驗參數有變化時，其結果不受影響的能力，如對放置時間進行考察，則得出保存條件和時限的依據；

方法：樣品放置于常溫一定時間后，操作方法同專屬性；

接受標準：5天內陽性對照的微生物生長良好，陰性對照無微生物生長，則設定5天為報陰時間；否則以微生物檢出時間下限為報陰時間；